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动物微生态制剂(益生菌)的标准、 评价规程、功能和发展趋势

来源:畜牧人网站 日期:2017-01-19 10:46 编辑:admin

近些年,益生菌和消化道菌群的功能、作用效应和机制等方面的研究已经成为动物和人类医学、营养学、饲料(食品)学、微生物学、免疫学和肠道健康科学等领域的研究热点。同时,动物益生菌或微生态制剂产业迅速发展,也存在不少问题:
 
①在菌株筛选方面,国内一些产品的基础研究工作很差,对所用菌种的生物特性了解甚少,甚至连千分之一的菌株信息都不了解;
②相当一部分产品功能不明显,有的企业还过度夸大应用效果。实践证明,没有优良的菌种是其产品功效不明显的最根本原因,这严重降低了该类产品的社会公信力,影响了该产业的持续健康发展;
③乳酸菌类益生菌产品的稳定性直接影响货架期和功效稳定性;
④行业标准不健全,行业发展呈现“羊群效应”,结果呈现“羊放青”。为促进行业发展,本文重点阐述了发达国家益生菌的标准和评价规程及功能的新进展,并就我国益生菌的发展方向提出了作者的观点。
 
 
1、外源益生菌进入动物消化道后,与胃肠道菌群再平衡后共同发挥作用
 
对于肠道菌群的全面认识有助于人们更好地管理和调控动物的肠道营养和健康。动物或人体在刚出生时,消化道内是无菌的,随后,外界环境中的微生物随着食物或饮水等逐渐进入消化道,并呈现从无到有、从少到多,其种类和数量逐渐增多,从剧增到缓增、此消彼涨,逐步进入稳定或平衡状态,这个过程称为菌群演替,并呈现多样性和动态平衡。在单胃动物或人消化道寄居(栖息)着10倍于体细胞数、100倍于人体基因组的1014个细菌(Ley等,2006),种类多达500~1 500种。最近研究表明,人有1 150种(Park, 2009),平均每个个体内约含有160种优势菌种,并且这些菌群是绝大部分个体所共有的,这些种群构成了复杂的微生态系统(micro-ecosystem),也有把这个系统称为“微生物器官”(microbial organ) 和“免疫器官”,肠道微生物菌群也是人类目前了解最少的“器官”(Gershwin等,2004;O'Hara 等,2006;Smith 等,2010)。因此,动物或人被称为“超级生物”。但每个个体都有自己独特的菌群,就象每个有不同的指纹一样。这些微生物与动物或人终生为伴,终生为益。可是在过去很长时间里,人们在动物养殖或饲料中大量使用抗生素来“消杀”肠道菌群,其实犯了一个严重的错误,不仅导致抗生素的滥用,也产生了多种负面效应(包括耐药性、药物残留、生态环境等)。今后,应该充分认识胃肠道微生物的客观存在和多种有益作用,采取“扶调”策略,合理管理和调控这些菌群,为动物的健康和饲料营养的消化利用发挥作用。
 
无论是单胃动物还是多胃动物,在其生长发育过程中,形成了固有的微生态系统,具有不同的优势菌群,呈现生物多样性。单胃动物(如猪禽和人等)的优势菌群是拟杆菌属(Bacteroides)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、优杆菌属又称真杆菌属(Eubacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、链球菌属(Streptococcus)、细梭菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)以及丙酸杆菌属(Propionibacterium)。多胃动物(如牛、羊等)的瘤胃是一个重要的微生态系统,其优势菌群主要有可降解纤维的纤维杆菌属(Fibrobacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、拟杆菌属(Bacteroides)以及普雷沃氏菌属(Prevotella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera),一些厌氧真菌、纤毛虫(原生动物)和产甲烷菌也出现在瘤胃中(Mackie等,2000)。此外,在通常情况下,动物肠道黏膜细胞中也寄生着大量病毒,从粪便排出的病毒有100 多个型别,每克粪便中可含100 多万个病毒颗粒。在肠道还存在大量噬菌体,噬菌体(bacteriophage 或phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒,噬菌体分布极广,凡是有细菌的场所,就可能有相应噬菌体的存在。噬菌体是肠道菌群的“杀手”,也是影响消化道菌群平衡的重要内在力量之一。这些微生物菌群(细菌、真菌等)、病毒、噬菌体存在着复杂的生态关系和营养食物链网络,它们彼此相互联系、相互制约, 并与宿主细胞之间不断地进行物质、信息、能量交流,其结构(组成)和比例影响着动物或人的健康。
 
消化道菌群通过其生物多样性发挥多种生物学功能。消化道不同的微生物菌群,与饲料或食物消化、吸收及营养代谢(Koletzko 等、Lewis 等、Tannock,2005;张日俊等,2005、2006;Crozier 等,2006;Martin等,2007;Li 等,2008;Brandtzaeg 等,2009;Lee 等,2009;Floch 等,2010)、能量利用(Muramatsu 等,1994;Floch等,2010)、人或动物的免疫(Lewis等,2014;Tannock,2002;张日俊等,2005;Lee 等,2009)、健康和肠道疾病(Acheson 等,2004;Isolauri,2004;Pickard 等,2004;Stagg 等,2004;Svennerholm 等,2004;Verdu等,2004;Verdu等,2004)以及其它疾病如人类的肥胖病(Ley 等,2006;Musso 等,2010b、a;Tilg,2010;Flint,2011)、代谢综合征(metabolic syndrome)(Tilg,2010)、糖尿病(Ley等,2006; Musso等,2010b)、生长发育有着密切关系(Hooper等,2001),共生的肠道微生物调节人体的代谢表型(Li等,2008),即肠道菌群影响人或动物的代谢活动和类型。
 
外源益生菌进入动物肠道后,与胃肠道菌群再平衡后共同发挥跨越肠道的多种作用。再平衡是指环境因素(益生菌、抗生素、益生元等给予或食物营养结构)变化引发肠道菌群的种类、结构和比例重新进行了微演替,并再次建立新环境下的新平衡。再平衡后的菌群(包含益生菌)通过不同器官的功能外延与不同生理系统间的物质、信息和能量交流及相互作用影响动物或人其它功能,包括病原的传递和感染、肿瘤的发生以及其口腔、肝脏、胃、呼吸系统、胰腺、中枢神经系统和骨质的健康,也影响到人的认知功能、肥胖和儿童成长等(Guarner等,2003;Charalampopoulos等,2009;Collado等,2009),这些影响都远远超越了肠道范围,跨越到动物或人体的多系统,从而产生广泛和多方面的生物学作用。
 
2、从不同的益生菌(微生态制剂)概念认识其组成和特性
 
益生素(probiotics) ,国内也称微生态制剂(microbial ecological agents),我国农业部官方称微生物饲料添加剂,是Parker(1974) 提出的与“抗生素”相对的新概念,指从动物或自然界分离、鉴定的有益微生物, 经发酵培养和后加工(如干燥、包被、不同剂型制剂)等特殊工艺制成的有益活菌制剂。FAO/WHO以及EFSA(the European Food Safety Authority)等广泛认可的定义是指当服用足够数量时能对宿主产生健康有益的活微生物(Hill等,2014)。这个概念强调了“足够数量”的活菌和促进健康作用。
 
笔者认为,如下的定义更能全面地反映目前市场所用益生菌的内涵。益生菌是含活菌和(或)死菌,包括其组分和产物的有益微生物制品,经口或经由其它黏膜途径投入,旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡,或者刺激特异性或非特异性免疫机制(德国国际会议,1994)。这个概念首先强调了它的组成,即有益活菌+组分+代谢产物,或有益死菌+组分+代谢产物,或有益活菌+死菌+组分+代谢产物;其次强调了它的使用途径(口服或黏膜给予)和作用(菌和酶的平衡、刺激特异和非特异性免疫)。因此,其越来越受到人们的关注,并广泛应用于畜牧业、饲料工业和其它相关产业,它正带动畜禽、水产、厩舍环境控制、粪污处理等领域的生产方式的根本性变革,国际上把它誉为“拯救地球的技术”,是饲料生物技术领域的重大革新技术。
 
3、益生菌选择标准和评价规程
 
3.1 益生菌菌株选择和制剂标准
 
建立益生菌选择标准和评价规程对微生态产业的有序和规范化发展十分重要。我国至今少有建立益生菌的标准,更没有建立评价规程。欧盟评价益生菌标准的规程见图1。
 
理想的益生菌应具备如下特性和安全标准(EFSA,2005):
⑴菌株没有毒性和病原性;
⑵菌株应有准确的分类鉴定;
⑶目标菌株能在消化道栖息;
⑷所选菌株能够在消化道的目标位置存活、定植和产生代谢活性(如产生消化酶、有机酸等),能够耐过胃液和胆汁、在胃肠道留存、粘附到肠上皮细胞或肠绒毛、能与常驻菌群竞争;
⑸菌株能够产生抗菌物质;
⑹菌株能够与病原菌拮抗;
⑺菌株能够调控免疫反应;
⑻菌株具有遗传稳定性;
⑼益生菌制剂能发挥至少一种有确实科学依据支持的促进健康作用(减少毒胺、中和内毒素等);
⑽制剂在加工、贮藏和运输过程中,菌株具有良好的可控性,其特性具有良好的稳定性;⑾制剂有良好的活性,包括菌株活性、代谢产物活性;⑿制剂在工业加工过程中,具有理想的风味和工艺特性。
相比之下,我国在益生菌筛选方面,相对粗糙和差距较大,特别是在上述⑴、⑷、⑻、⑼、⑿项目上缺乏科学扎实的研究。
 
3.2 欧盟和FAO/WHO的益生菌评价规程
 
欧洲联合会基金项目“人用益生乳酸菌的生物安全评价”(PROSAFE)的目标是提出基于安全性评估证据基础上的人用益生菌的推荐规范。
 
这个项目的结论在2006年一次研讨会上提出建议:
①分子的方法,如核糖体DNA测序,在非常权威和专业的实验室进行,进行准确的分类。此外,益生菌菌株应存入公共菌种保藏中心。
②对抗生素有抗性的非野生型(或人工改造)微生物未经过恰当的风险评估,不应该作为未来人或动物的产品开发。
③应避免使用肠球菌(如粪肠球菌等)或其它有毒性基因的乳酸菌。其他特性,包括胆汁酸脱抱合作用、黏附细胞作用和与毒性无关的细胞外基质蛋白以及益生菌在体外结肠的模型中存活都认为与生物安全评估无关。
④除了体内安全评估准则外,通过随机的、安慰剂对照和双盲设计研究在人类的定植情况,但这样研究的细节并不是特定的。
⑤运用动物模型来测定安全性是很有争议的。然而,实验性心内膜炎大鼠模型被认为是最可靠的动物模型。
 
FAO/WHO 在2002也建立了一套与欧共体类似的安全性评估指导规则。要点如下:
①建立传统产品的安全使用历史;
②不能存在抗生素耐药性转移的风险;
③不能出现毒性风险;
④要评估某种特定的代谢活性,如D-乳酸盐生产、胆汁盐脱抱合;
⑤如果某菌株是一种已知的哺乳动物毒素生产者,需要测试毒素生产情况和安全性;
⑥如果某菌株是具有已知的溶血潜能,就应测定其溶血活性;
⑦评估产品有无副作用;
⑧产品销售市场后,对消费者使用后出现的各种不良事件,应进行流行病学监测。
 
3.3 理想的益生菌菌株选育应遵从特异性和多样性原则
 
产品开发者和使用者都要注意菌株的特异性,即同名的不同菌株的生物学特性会有较大差异性,而且其所发挥的作用或功效也是不同的,具有株、种、属的特异性(差异性)。这种差别表现在多方面,如生长快慢、抗逆性(抗酸、碱、胆盐、热等)、产酸特性、死亡菌体对大肠杆菌或沙门氏杆菌等病原菌的抗黏附性、产酶特性(动物和微生物都可以产生的消化酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等,只有某些(不是所有)微生物能产生非淀粉多糖酶、纤维素酶等)、是否产生抗菌物质、是否对生产性能(如饲料转化效率、肉蛋奶产量等)有正效应、是否具有免疫刺激特性以及加工和储运特性等。对有条件的企业,还应该对所选的优秀菌株进行全基因组测序,通过功能基因组学进一步了解所选菌株的生物学特性,作者课题组2014年完成了益生芽孢杆菌LFB112的全基因组测序,这也是我国第一株测序的益生芽孢杆菌,在GenBank中的登录为CP006952,从基因组信息获知该菌的185个代谢途径产生7种抗菌物质以及产生多种酶、有机酸、维生素、调节免疫等多种信息。希望生产企业深入筛选菌种,使用者认真选择产品。
 
我国目前市场上许多益生菌产品中所用菌株的特异性和多样性不明显。农业部2013年公布了我国允许添加的微生物种类有34种,但在各类益生菌产品中实际所用的菌种最多的是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母,其次是嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、乳酸片球菌、戊糖片球菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、丁酸梭菌,目前还没有一种产品含有双歧杆菌。长期过度、过多、过集中地使用某几种益生菌有可能导致使用效果(功效)降低,而且破坏大生态的微生物平衡。自然生态界遵循多样性原则,即多样性越丰富,生态环境越稳定、越健康。因此,呼吁开发和生产益生菌的企业应尽量增加益生菌的多样性。
 
4、益生菌(微生态制剂)的生物学功能
 
益生菌或微生态制剂的功能可以简单概括为三大方面,即生理机能调节功能、健康保护功能和营养调控功能。益生菌能否产生明显的正效应取决于益生菌在肠道内是否自身能形成优势菌群或通过其调控作用形成另外一种或几种内源性有益优势菌群。必须指出的是,如下所述的益生菌作用也不是所有的益生菌都能具有的,是益生菌的菌株特异性所致。
 
4.1 益生菌对宿主生理机能的调节
 
优秀的益生菌进入消化道后,其自身或通过调控内源有益菌形成优势菌群,对动物机体的生理功能产生重要影响。
①促进幼龄动物消化道的发育和成熟(如腔室体积增加、消化道壁结构复杂化)或促进生长动物肠道绒毛的密度和长度增加;
②降低消化道内容物的pH值、氧化还原电位和改变其化学成分等;
③对消化道肠蠕动、上皮细胞再生的影响;
④菌群消耗营养产生的代谢产物影响动物体代谢途径;
⑤某些益生菌还可降低动物的应激反应,如热应激引起的蛋鸡产蛋量下降;⑥有些益生菌还能与共生菌协同降低有害菌导致的缓慢亚临床炎性反应。
 
4.2 益生菌对宿主健康的保护功能
 
益生菌的健康保护作用表现在4大屏障作用方面(Salminen 等,1996;Gionchetti 等,2005;Isolauri 等,2005;Luyer等,2005;Penna等,2008;Resta-Lenert等,2009)。
 
4.2.1 机械屏障
 
机械屏障是由肠道黏膜上皮细胞,上皮细胞间紧密连接,以及肠表面黏液等构成,能有效阻止细菌穿透黏膜进入深部。益生菌有利于加强肠道上皮细胞间的紧密连接,促进杯状细胞黏液的分泌及抑制肠上皮细胞的凋亡,进而维持胃肠道黏膜组织的完整性,抵制致病菌对肠黏膜的破坏。
 
4.2.2 生物屏障
 
肠腔表层称为腔菌群,主要为大肠杆菌、梭状芽孢杆菌等;深层的为膜菌群,主要是具有黏附特性的双歧杆菌和乳酸杆菌。益生菌或膜菌群通过占位保护产生细菌素、有机酸、过氧化氢等物质来阻止或抑制致病菌和条件致病菌侵袭黏膜。
 
4.2.3 免疫屏障
 
肠道是天然免疫和获得性免疫的重要场所,能够保护肠道免受外来的抗原破坏和免遭异常的免疫应答反应,它主要由肠道相关淋巴组织(派伊尔氏结、肠系膜淋巴结等)、细胞(肠上皮细胞、抗原递呈细胞、T细胞、B 细胞等)和分子(防御素、细胞因子、免疫球蛋白等)构成。研究表明,肠道菌群或益生菌可通过改善肠上皮细胞免疫功能以及肠道抗原递呈细胞、淋巴细胞(T细胞、B细胞)等的功能来调节机体的免疫功能。
 
4.2.4 化学屏障
 
由消化道分泌的胃酸、溶菌酶、细菌素、黏多糖和蛋白分解酶以及胆汁等构成了肠道化学屏障,具有一定的杀菌和溶菌作用。益生菌或内源微生物通常能产生有机酸,有的益生菌还能产生细菌素、过氧化氢等发挥化学屏障作用。
 
4.3 益生菌对宿主的营养调控作用
 
营养调控作用是指益生菌在消化道内发挥了一系列类似营养素的作用,即通过益生菌产生的消化酶(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、非淀粉多糖酶、纤维素酶等)、代谢产酸(乳酸、醋酸、丙酸、丁酸等)、维生素、氨基酸等发挥一系列营养调控作用。但发挥这些作用是以大量益生菌和肠道内源微生物消耗能量物质为代价的。如果益生菌消化了一定量的营养而没有产生更多的有益作用,这种益生菌产品则表现出的功效不明显或负效应。大量研究表明,益生菌和内源菌在肠道代谢产生的短链脂肪酸(SCFA)可在盲肠和结肠通过被动扩散吸收,然后穿过上皮进入不同的组织或器官代谢,如乙酸在肌肉、脾、心脏、脑内代谢,丙酸参与肝脏的吸收和代谢和糖异生作用,丁酸在结肠上皮代谢,维持正常细胞分化,结肠上皮细胞能量的60%~70%来自细菌发酵。双歧杆菌可产生磷蛋白磷酸酶,可增加蛋白质的吸收、利用和贮留,还通过抑制腐败菌来减少养分的消耗;有些微生物能利用氨态氮,提高氮利用,并可减少氨气、生物胺、硫化氢等的形成,改善畜舍环境,减少排泄物中氮、磷的排放。双歧杆菌能合成VB1、VB6、VB9、VB12;嗜热链球菌、保加利亚乳酸乳杆菌产叶酸,后者还产生VB2、VB6(张日俊, 2003b)。
 
4.4 其它功能:跨越肠道影响宿主肝、胰、神经等功能
 
外源益生菌或内源菌群通过肠道上皮细胞、弥散的淋巴组织、神经细胞(如脑肠轴)等与宿主的不同生理器官或组织进行物质、信息和能量交流及相互作用,进而影响宿主的其它功能,如肠道病原的传递和感染、肿瘤的发生以及其口腔、肝脏、胃、呼吸系统、胰腺、中枢神经系统和骨质的健康,也影响到人类的认知功能、肥胖和儿童成长等(Guarner等,2003;Charalampopoulos等,2009;Collado等,2009),这些影响都远远超越了肠道范围,跨越到宿主的多种器官和组织。
 
5、益生菌发展趋势
 
在益生菌或动物微生态研究领域,运用分子生物学、悉生动物学、元(宏)基因组学、益生菌基因组学、代谢组学、转录组学、蛋白质组学、微生物发酵工程等领域的先进技术和方法,深入研究消化道微生物或益生菌与宿主营养代谢、免疫、生长发育、健康、疾病以及产品品质之间的相互关系和作用机理,特别是通过肠道宏基因组,发现有价值的微生物功能基因,并加以挖掘、开发和利用,这是未来基础理论研究的热点和重点。另外,益生菌(微生态制剂)、益生元(或合生元)在抗感染(生物防治)、营养与免疫调控、抗生素替代、恢复生态、健康养殖和食品安全中发挥重要的作用,必将成为未来应用研究的热点。
 
在益生菌或动物微生态产业方面,有“四驾马车”,一是与健康养殖业结合,开发饲养环境控制和减排的微生态制剂;二是与饲料工业结合,开发低成本的、适于饲料添加的饲用抗生素替代品、饲料消化改善剂,并加强益生菌培养物和生物饲料专用制剂的开发;三是与动物保健业结合,开发动物生防制剂、发酵中草药、免疫调节剂、生物兽药(如细菌素)以及传递特异性病原性抗原基因的益生菌,当然后者目前受到国家政策的限制;四与动物环保产业结合,开发动物粪便污水处理制剂。
 
就市场而言,据美国Transparency市场研究机构的调研,到2018年益生素和益生元的全球市场达到$44.9 billin(449亿美元,约即2 700亿人民币)。益生菌是生物饲料(俗称发酵饲料)的核心技术之一,生物饲料是21世纪饲料工业的最后一桶“黄金”,据估计,再经过3~5年的发展,生物饲料可占到饲料总产量的15%~20%,其产量可能达到0.4~0.6亿吨。但市场竞争也愈加激烈,市场竞争的核心是技术,正确的选择是产学研合作,希望微生态科学和产业的明天会更美好。
 
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